Методическое пособие к лабораторным занятиям, задания для самостоятельной работы и контроля знаний студентов


Скачать 443.4 Kb.
НазваниеМетодическое пособие к лабораторным занятиям, задания для самостоятельной работы и контроля знаний студентов
страница1/4
Дата публикации01.06.2014
Размер443.4 Kb.
ТипМетодическое пособие
referatdb.ru > Биология > Методическое пособие
  1   2   3   4


БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ
Кафедра биохимии




БИОЭНЕРГЕТИКА


Методическое пособие

к лабораторным занятиям,

задания для самостоятельной работы

и контроля знаний студентов




МИНСК

2010

УДК 577.113 (076.5)

ББК 28.072 я 73
Б63


Авторы-составители:

О. И. Губич, С. И. Мохорева


Рекомендовано Ученым советом

биологического факультета

25 марта 2010 г., протокол № 8


Рецензент:

кандидат биологических наук,

доцент^ Е. А. Храмцов


Б63

Биоэнергетика: методическое пособие к лабораторным занятиям, задания для самостоятельной работы и контроля знаний студентов / авт.-сост.: О. И. Губич, С. И. Мохорева. – Минск: БГУ, 2010. – 40 с.


В методическом пособии приводятся методы количественного и качественного определения макроэргических соединений и компонентов дыхательной цепи в биологическом материале, методы определения активности ключевых ферментов энергетического обмена клетки, а также методы, используемые для исследования процесса окислительного фосфорилирования в дыхательной цепи митохондрий. В пособие включены вопросы для самоконтроля знаний и творческие задания по курсу “Биоэнергетика”.

Пособие предназначено для студентов 5 курса биологического факультета БГУ специальности 1-31 01 01 “Биология”, специализирующихся на кафедре биохимии.

УДК 577.113 (076.5)

ББК 28.072 я 73
© БГУ, 2010




ВВЕДЕНИЕ
Настоящее пособие посвящено экспериментальным приемам и методам, использующимся при изучении биоэнергетических процессов в тканях животных.

Материал настоящего методического пособия был составлен, исходя из конкретных задач, стоящих перед биохимиком в практической работе. Весь предлагаемый материал изложен так, что после краткого рассмотрения теоретических основ раздела дается описание и техника проведения конкретных методов.

Пособие состоит их пяти разделов:

1. Определение содержания и основных характеристик макроэргических соединений и компонентов дыхательной цепи.

2. Исследование активности ключевых ферментов энергетического обмена клетки.

3. Изучение процесса окислительного фосфорилирования в митохондриях.

4. Подготовка биологического материала для изучения биоэнергетических процессов.

5. Вопросы и задания для самоконтроля знаний.

Первый раздел призван помочь студентам освоить спектрофотометрические и флуориметрические методы количественного и качественного определения содержания важнейших макроэргов (АТФ, креатинфосфат) тканей животных и некоторых компонентов дыхательной цепи (никатинамидадениндинуклеотид, цитохромоксидаза). Во втором разделе студенты знакомятся с современными методами изучения важнейших ферментов катаболизма (пируваткиназы, сукцинатдегидрогеназы, креатинкиназы). В третий раздел включены методы изучения сопряжения дыхания и окислительного фосфорилирования в дыхательной цепи митохондрий, действия разобщителей на интенсивность образования АТФ на сопрягающей мембране и транспорт ионов в митохондриях. Четвертый раздел знакомит студентов с наиболее используемыми методами подготовки биологического материала к последующему анализу. В пятый раздел включены тестовые вопросы, задачи, творческие задания, темы рефератов, позволяющие студентам проверить свои знания по курсу “Биоэнергетика” и облегчающие их подготовку к экзамену.

Приведенные в практикуме методики максимально используют доступное лабораторное оборудование и реактивы. Уровень приводимых в пособии методических приемов соответствует требованиям современной науки, регламентируется учебными программами и учитывает технические возможности проведения учебного процесса на современном уровне. Каждая предлагаемая студентам работа представляет собой небольшое экспериментальное исследование. При выполнении работы студент должен самостоятельно подготовить все необходимые реагенты, освоить необходимые методики, провести эксперимент и оформить результаты в виде отчета, иллюстрируя полученные данные таблицами и графиками.

Данное пособие способствует, углубляет и стимулирует самостоятельную подготовку студентов по курсу “Биоэнергетика”, развивает их творческую активность, повышает уровень и качество подготовки современных специалистов-биохимиков.

Все замечания и пожелания, касающиеся улучшения представленного в практикуме материала, будут приняты авторами с благодарностью.


1. Определение содержания и основных характеристик макроэргических соединений и компонентов дыхательной цепи
^ 1.1. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУММАРНОГО СОДЕРЖАНИЯ Основных макроэргов В СКЕЛЕТНОЙ МУСКУЛАТУРЕ КРЫС
Принцип метода. К макроэргическим относят соединения, при гидролизе которых выделяется не менее 7 ккал энергии на моль преобразуемого вещества. Основными макроэргами мышечной ткани являются АТФ и креатинфосфат. Образование АТФ в мышечной ткани связано, главным образом, с процессом окислительного фосфорилирования в митохондриях. Креатинфосфат образуется в мышцах при участии АТФ в состоянии покоя и служит резервом высокоэнергетического фосфата для синтеза АТФ при активной мышечной работе.

Предлагаемый метод основан на том, что два последних остатка фосфорной кислоты в АТФ, как и фосфорный остаток в креатинфосфате, легко отщепляются при непродолжительном гидролизе в кислой среде (лабильно связанный фосфор). Сравнение содержания неорганического фосфора в пробах до и после гидролиза дает представление о количестве лабильно связанного фосфора, которое приходится на макроэргические соединения мышечной ткани. Количество фосфора определяют по цветной реакции с молибдатом аммония в присутствии аскорбиновой кислоты.
Реактивы:

1. 2,5 % раствор ТХУ

2. 1 моль/л раствор HCl

3. 1 моль/л раствор NaOH

4. 1% раствор молибдата аммония

5. 1% раствор аскорбиновой кислоты
Ход работы. 0,5 г скелетной мускулатуры крыс гомогенизируют на льду в 5 мл охлажденного 2,5 % раствора ТХУ. Гомогенат фильтруют, осадок на фильтре промывают 5 мл холодной дистиллированной воды. Объем безбелкового фильтрата доводят до 10 мл.


5

Полученный безбелковый фильтрат используют для определения макроэргических соединений, как описано в следующей таблице:


Реагенты

Количество реагента, мл

Опыт

Контроль

Безбелковый фильтрат

0,5

0,5

1моль/л раствор HCl

1,0

1,0




Кипятить 10 мин для обеспечения гидролиза фосфорных связей, охладить *

Не кипятить

1моль/л раствор NaOH

1,0

1,0

Дист. вода

7,5

7,5

Перенести по 5 мл в чистые пробирки

1% раствор молибдата аммония

0,5

0,5

1% раствор аскорбиновой кислоты

0,5

0,5

Дист. вода

2,0

2,0

Смесь в пробирках тщательно перемешать, выдержать 10 минут при комнатной температуре

Колориметрировать при 670 нм против дист. воды


* В опытной пробе (после гидролиза) определяемый неорганический фосфор представляет собой совокупность лабильно связанного фосфора и фосфатов, присутствующих в тканях, в контрольной пробе – только фосфаты в ткани.
Из оптической плотности опытной пробы вычитают оптическую плотность контроля. Содержание лабильно связанного неорганического фосфора в пробе находят по калибровочному графику.

Рассчитывают количество лабильно связанного фосфора, учитывая разведение:

X= 1, 32 ·10-6 ·A,

где Х – содержание макроэргических соединений в перерасчете на 1 мг АТФ в 1 кг сырой массы ткани,

А – содержание макроэргов в пробе, мг,

1, 32 ·10-6 – коэффициент пересчета на 1 г ткани с учетом разведения растворов.

^ 1.2. Определение содержания фосфокреатина в скелетной мускулатуре крыс
Принцип метода. Креатинфосфат, характеризующийся высокой лабильностью в кислой среде, можно определить по содержанию фосфора методом Фиске и Суббароу в безбелковом экстракте, из которого предварительно удален неорганический фосфат.
Реактивы:

1. Магнезиальная смесь – 5 г MgCl2 х 6 Н2О и 10 г NH4Cl растворяют в 50 мл воды и добавляют 5 мл концентрированного аммиака.

2. 0,5% спиртовой раствор фенолфталеина.

3. 2,5 % раствор (NH4)2MoO4

4. 5 н раствор Н2SO4

5. Молибденовый реактив – смесь равных объемов молибденово-кислого аммония (1) и серной кислоты (2).

6. Эйконоген

Основной раствор: 125 мг эйконогена, 7,5 г NaHSO3 (или 7 г Na2S2O5) и 250 мг NaSO3 растворяют в 50 мл воды.

^ Рабочий раствор: 1 объем основного раствора эйконогена и 4 объема дистиллированной воды тщательно смешивают, при необходимости фильтруют.

7. Стандартный раствор фосфата (KH2PO4), содержащий 2 мкмоль фосфата в 1 мл.
^ Ход работы. К 1 мл безбелкового раствора, полученного, как описано в разделе 4.1, приливают 1,5 мл магнезиальной смеси, добавляют 1 каплю фенолфталеина (розовое окрашивание). После тщательного перемешивания пробирки оставляют на льду на 30 мин, периодически их встряхивая. Образовавшийся осадок аммониево-магниевой соли фосфорной кислоты удаляют фильтрованием. Отбирают 1,5 мл фильтрата и проводят в нем определение фосфора по методу Фиске и Суббароу.

Для этого к 2,5 мл исследуемого раствора добавляют 1,5 мл молибденового реактива и тщательно перемешивают. Затем добавляют 1 мл рабочего раствора эйконогена, перемешивают и оставляют при температуре 37 °С на 10-15мин. После этого раствор охлаждают и фотометрируют при 625 нм. Содержание фосфата в пробе рассчитывают по калибровочному графику, построенному по стандартному раствору фосфата, взятому в количестве 0,2 – 2 мкмоль на пробу. Рассчитывают количество креатинфосфата в 1 г исходной навески ткани.

^ 1.3. Обнаружение НАД в дрожжах
Принцип метода. НАД легко извлекается из дрожжей горячей водой (он термостабилен) и может быть обнаружен по образованию флуоресцирующего комплекса с ацетоном.
Реактивы:

1. Ацетон

2. Раствор NaOH – 300 г/л

3. HCl (конц.)

4. Спиртовой раствор фенолфталеина – 5 г/л.
Ход работы. В пробирку поместить кусочек дрожжей величиной 4-5 мм, добавить 1/3 пробирки дист. воды и кипятить 30 секунд с воздушным холодильником.

Отфильтровать в пустую пробирку 10 капель полученного экстракта, добавить 5 капель ацетона и 2 капли раствора NaOH. Инкубировать пробу 2 мин при комнатной температуре, после чего добавить 1 каплю спиртового раствора фенолфталеина и по каплям соляную кислоту до обесцвечивания раствора. Пробирку в процессе добавления кислоты необходимо аккуратно встряхивать.

Пробирку помещают в кипящую водяную баню на 2 минуты, затем охлаждают и измеряют уровень флуоресценции.

Ацетоновый комплекс НАД флуоресцирует синим светом.

^ 1.4. СОПОСТАВЛЕНИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНОГО ПОТЕНЦИАЛОВ РИБОФЛАВИНА И ИНДИКАТОРА МЕТИЛЕНОВОГО СИНЕГО
Принцип метода. Для исследования окислительно-восстанови-тельных потенциалов применяются индикаторы, меняющие свой цвет при определенном значении окислительно-восстановительного потенциала. Например, метиленовый синий (синий в окисленном состоянии) превращается в лейкометиленовый синий (бесцветный в восстановленной форме).
Реактивы:

1. Цинк гранулированный

2. Соляная кислота (конц.)

3. Взвесь рибофлавина - 0,25 г/л

4. Раствор метиленового синего – 0,1 г/л
Ход работы. В пробирку вносят 5 капель воды, 2 капли взвеси рибофлавина и по каплям метиленовый синий – до синего или зеленоватого окрашивания раствора. Внести в пробирку кусочек цинка и 2-3 капли конц. соляной кислоты (начинается выделение пузырьков водорода).

По мере насыщения раствора водородом окислительно-восстановительный потенциал смеси постепенно снижается и происходит восстановление рибофлавина и метиленового синего. Восстановление всего объема метиленового синего (Е0 = +0,11 В) происходит раньше, чем восстановление значительной части внесенного в пробирку рибофлавина (Е0 = - 0,20 В), поэтому цвет жидкости переходит последовательно в зеленый, желто-зеленый, желтый, бледно-желтый или розовый и, наконец, жидкость обесцвечивается за счет восстановления рибофлавина в лейкосоединение.

Бесцветную или розовую жидкость сливают в другую пробирку и наблюдают за изменением окраски. Водород в жидкость больше не поступает, а уже растворенный в ней уходит в воздух и переносится через рибофлавин и метиленовый синий на кислород воздуха (Е0 = + 0,82 В). В результате происходит постепенное повышение окислительно-восстановительного потенциала, после расходования в растворе водорода начинается окисление восстановленного рибофлавина. Он передает водород через индикатор метиленовый синий на кислород и желтеет (часть водорода поступает к кислороду, минуя индикатор). После этого начинается окисление лейкометиленового синего – раствор становится сначала зеленым (желтый и синий цвет дают зеленый) и затем синим).

^ 1.5. ОБНАРУЖЕНИЕ ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ В СКЕЛЕТНОЙ МУСКУЛАТУРЕ КРЫС
Принцип метода. Цитохромоoкидаза – заключительный фермент в дыхательной цепи митохондрий. При участии кислорода он способен окислять не только предшествующие ему компоненты дыхательной цепи, но и некоторые другие соединения, например, диметилпарафенилендиамин и α-нафтол. При окислении последних образуется индофеноловая синь, интенсивность синей окраски которой пропорциональна активности фермента. Указанная реакция не протекает в тканях человека и животных, однако широко используется для обнаружения цитохромоксидазы. По первым слогам слов “нафтол” и “диметил” она была названа реакцией НАДИ, а реактив, содержащий нафтол и диметилпарафенилендиамин, реактивом НАДИ.

Метод выявления цитохромоксидазы реактивом НАДИ используется в клинике и цитологии для выявления этого фермента в биоптатах и мазках клеток крови с целью диагностики нарушений тканевого дыхания, вызванного отравлением цианидами, сульфидами, азидами и другими соединениями, взаимодействующими с железом гемма цитохромоксидазы.
Реактивы:

1. 1% водный раствор диметилпарафенилендиамина

2. 1% спиртовой раствор диметилпарафенилендиамина

3. 1,5% раствор карбоната натрия

4. 1,5 % раствор α-нафтола

5. Реактив НАДИ (готовится за 1 час до определения): 1 мл 1% водный раствор диметилпарафенилендиамина смешивают с 1 мл его 1% спиртового раствора, 1 мл 1,5% раствора карбоната натрия и 1 мл 1,5 % раствора α-нафтола.

6. 0,9% раствор NaCl
^ Ход работы. 1 г скелетной мышцы крысы растирают в 5 мл 0,9% раствора NaCl. Половину полученной суспензии переносят в пробирку и кипятят на водяной бане в течение 25 мин (термоинактивация цитохромоксидазы). По окончании времени кипячения содержимое пробирки фильтруют через бумажный фильтр. На фильтр с денатурированными мышечными белками наносят 3 капли реактива НАДИ, наблюдают отсутствия окрашивания (фермент инактивирован).

Параллельно с этим, фильтруют мышечную суспензию, не подвергнутую нагреванию. На фильтр с неденатурированным ферментом наносят 3 капли реактива НАДИ, наблюдают постепенное окрашивание фильтра в сине-фиолетовый цвет.
  1   2   3   4

Похожие рефераты:

Учебно-методическое пособие Экономическая и социальная география...
В работе представлены система лабораторно-семинарских работ, задания для самостоятельной работы студентов и контроля. Пособие предназначено...
Методическое пособие к лабораторным занятиям по специальному курсу...
Комплексный подход при оценке программируемой гибели (апоптоза) клеток человека : метод пособие к лабораторным занятиям по специальному...
Экономическая теория Тестовые задания Часть I
Учебно-методическое пособие для контроля знаний студентов, обучающихся по специальностям 1-74 03 01«Зоотехния»
Учебно-методическое пособие для студентов педиатрического факультета....
М. П. Волкова, Н. С. Парамонова (кафедра педиатрии №2) – Детские болезни. Учебно-методическое пособие для студентов педиатрического...
Методическое пособие к лабораторным работам по палеонтологии Для...
Определитель ископаемых остатков Phylum Mollusca. Часть 1 (Classis Loricata, Bivalvia, Scaphopoda, Monoplacophora, Gastropoda): методическое...
Учебно-методическое пособие по библиографическим дисциплинам для...
Учебно-методическое пособие предназначено студентам, обучающимся заочно по специальности «Библиотековедение и библиография». Материалы...
Методическое обеспечение самостоятельной работы студентов разделы...
Докажите, что этническая психология может быть вполне самостоятельной отраслью научных знаний
Методическое пособие к семинарским занятиям для студентов экономических...
Национальная экономика Беларуси: методическое пособие к семинарским занятиям для студентов экономических специальностей / Л. И. Дроздович,...
Учебно-методическое пособие к лабораторным работам по дисциплине «Основы взаимозаменяемости»
О-75 Основы взаимозаменяемости: учебно-методическое пособие к лабораторным работам для студентов машиностроительных специальностей...
Учебно-методическое пособие к лабораторным работам по дисциплине «Основы взаимозаменяемости»
О-75 Основы взаимозаменяемости: учебно-методическое пособие к лабораторным работам для студентов машиностроительных специальностей...

Вы можете разместить ссылку на наш сайт:
Школьные материалы


При копировании материала укажите ссылку © 2013
контакты
referatdb.ru
referatdb.ru
Рефераты ДатаБаза